Anna Lacasta^1,2 y Fernando Rodríguez¹

1. Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (IRTA), Campus UAB, Bellaterra, 08193 Barcelona, Spain.
2. International Livestock Research Institute (ILRI), 00100 Nairobi, Kenya.

Peste Porcina Africana: una amenaza real para la que no existe vacuna

La peste porcina africana (PPA) es una enfermedad hemorrágica altamente infecciosa causada por el virus de la PPA (VPPA), que afecta principalmente a cerdos domésticos. Aún, a día de hoy, no existe una vacuna eficaz para un virus tan complejo y el control de la enfermedad se basa en un diagnóstico precoz y en el sacrificio masivo de los animales infectados, causando verdaderos estragos socio-económicos en los países afectados. La enfermedad es históricamente endémica en África, donde su erradicación es muy complicada debido al ciclo vital del virus y a las pobres infraestructuras para la cría. Desde que en 2007 se registrara un nuevo brote en la República de Georgia, la enfermedad se encuentra en plena expansión en Europa, amenazando directa o indirectamente al resto de un mundo cada día más globalizado.
Uno de los motivos por los que aún no existe una vacuna eficaz contra la PPA es el casi total desconocimiento sobre los mecanismos inmunológicos implicados en protección. Por este motivo los investigadores del IRTA-CReSA liderados por el Dr. Fernando Rodríguez, en colaboración con la Universidad de Córdoba (UCO) y el Centro de Biología Molecular Severo Ochoa de Madrid (CBMSO) han estado trabajando en un proyecto común, financiado por el Gobierno español, con el objetivo de arrojar un poco de luz en tan complicada temática. Los resultados aquí presentados forman parte de la tesis doctoral de Anna Lacasta y han sido recientemente publicados en el prestigiosa revista Veterinary Research (Lacasta et al., Vet Res. 2015;46(1):135).

Lecciones aprendidas de la utilización de virus atenuados del VPPA

La eficiencia del uso de virus atenuados como vacunas ya se demostró décadas atrás, aunque en su gran mayoría su capacidad protectora se ve reducida a virus homólogos (Ruiz-Gonzalvo et al; 1983), dejando a los animales desprotegidos frente a infecciones heterólogas (producidas por virus distintos al vacunal). Pese a la imposibilidad, por el momento, de utilizar virus atenuados en campo debido a su capacidad infectiva (virulencia residual inadmisible para un virus como éste, sobre todo en áreas libres de la enfermedad), nadie duda de su innegable utilidad en el laboratorio para profundizar en el conocimiento de los mecanismos involucrados en protección frente a la PPA. Esta temática es precisamente la que aquí se trata, comparando en este caso la cinética de la infección in vivo del virus atenuado E75CV1 (adaptado a la línea celular CV1) y de su homólogo virulento E75 (crecido en macrófagos alveolares porcinos, célula diana natural del VPPA).
Tanto los mecanismos implicados en inmunopatogenia como los involucrados en protección fueron abordados desde una perspectiva multi-disciplinar utilizando técnicas de virología clásica, moleculares e inmunológicas.

La primera lección aprendida consistió en la demostración de la sorprendente dependencia de la dosis del virus E75CV1 a la hora de reproducir el fenotipo atenuado. Así, de las 3 dosis evaluadas: 102 unidades hemadsorbentes al 50% (UHA50), 104 UHA50 o 105 UHA50 de E75CV1, únicamente la intermedia (104 UHA50), se comportó como cabía esperar para un virus atenuado, sin provocar ninguna baja (fig. 1) y solo provocando un pico de fiebre y de viremia totalmente transitorio en alguno de los animales. Por el contrario, tanto el uso de 10 veces más virus como de 100 veces menos demostró no ser seguro, observándose en ambos casos una mortalidad en el 50% de los cerdos infectados (véase fig. 1).
Estos resultados reflejan el fino equilibrio existente entre patogenia y protección, en el cual resulta clave el estatus inmunológico del cerdo; segunda lección ratificada utilizando cerdos libres de patógenos (SPF, del inglés specific pathogen free). Así, la misma dosis que resultaba inocua para el cerdo doméstico, 104 UHA50 de E75CV1, resultó fatal para el 100% de cerdos SPF (véase fig. 1; rombo negro) (Lacasta et al; 2014). La dependencia de la dosis y del estado inmunológico en el fenotipo atenuado confirma la imposibilidad del uso de este tipo de cepas en campo, donde nos podemos encontrar con animales inmunodeprimidos que no solo no superarían la infección sino que podrían servir como diseminadores de la enfermedad.

Aprovechando la optimización de la dosis de E75CV1 para cerdo doméstico (104 UHA50), dosis que no solo es segura, sino que genera tanto una potente respuesta de anticuerpos como una respuesta celular (datos no mostrados), se realizó un experimento de patogenia comparada, siguiendo la cinética de infección de ambos virus, utilizando por primera vez dos virus homólogos de origen común, pero que difieren en virulencia: el atenuado E75CV1 y el virulento E75. El sacrificio seriado de los animales a días 1, 7 y 31 (éste último solo en el caso de los grupos control e infectados con E75CV1), permitió estudiar directamente los órganos diana de infección para su análisis transcriptómico (niveles de RNAm, en el linfonodo gastrohepático en este caso) y así evitar falsas interpretaciones que el uso de otros sistemas de muestreo periféricos (sangre, hisopos…) podrían ocasionar, pese a su gran utilidad en otro tipo de estudios. Ambas infecciones progresaron como se esperaba, tanto a nivel de signos clínicos como de la evolución de la detección de virus en sangre, en excreciones y en tejidos, incluyendo el linfonodo gastrohepático (fig. 2).

Así, E75 se comportó como un virus altamente virulento demostrando, los animales infectados, signos clínicos compatibles con PPA aguda a partir de los 3 días post-infección (pi.), comparado con los animales infectados con E75CV1 que mostraban una ausencia casi total de signos clínicos y títulos máximos de virus en linfonodos 4 y 5 logaritmos menores que los detectados tras la infección con el aislado virulento E75 (véase fig. 2A). La enorme cantidad de virus detectada a día 7 pi. con la cepa virulenta E75 correlacionó a la perfección con la detección post-mortem de dramáticas lesiones compatibles con PPA aguda en diversos órganos diana del virus, especialmente en hígado, riñones, bazo y linfonodos, todos ellos totalmente congestionados y con hemorragias masivas (fig. 3). En contraposición, las necropsias de los animales infectados con la cepa atenuada E75CV1, resultaban prácticamente indistinguibles a las de los animales control sin infectar. Teniendo en cuenta la afectación de la estructura microscópica de los tejidos, la pérdida de peso relativa del órgano afectado, los títulos virales, la presencia de infiltrados de macrófagos, la apoptosis y la presencia de antígeno viral, se pudo confirmar la idoneidad del linfonodo gastrohepático como el órgano ideal a elegir para el estudio de transcriptómica (medición de RNA mensajero (RNAm) para cuantificar los niveles relativos de transcripción de genes determinados). En una primera aproximación decidimos estudiar la transcripción relativa diferencial de 19 genes relacionados con la respuesta innata y/o adaptativa mediante PCR quantitativa (qPCR, del inglés quantitative PCR). Sorprendentemente, tan pronto como a día 1 pi. con E75CV1 diez genes inmunomoduladores ya se encontraban diferencialmente activados, mientras que con E75 (virulento) tan solo 4 de ellos lo estaban (fig. 4A). En nuestra opinión, estos resultados reflejarían de alguna manera la incapacidad del sistema inmunitario para detectar y controlar la inmediata replicación del virus virulento (E75), permitiendo así su rápida diseminación por todo el organismo. Esta estrategia de evasión temprana del sistema inmune, facilitaría a su vez utilizar a tiempos tardíos el mismo sistema defensivo del organismo para amplificar el daño tisular, pudiendo así considerar de enorme relevancia para entender la patogenia de cepas agudas del VPPA todos aquellos fenómenos de inmunopatogenia disparados a tiempos tardíos tras la infección. Coincidiendo con esta hipótesis de partida, a día 7 pi., concurriendo el máximo daño tisular, se pudo detectar un claro desbalance del sistema inmunitario de los cerdos infectados con E75, reflejado tanto con la sobre-expresión de multitud de mediadores inmunológicos a nivelde RNAm en linfonodos (fig. 4B), como de proteína detectada en suero (datos no mostrados); coincidiendo con lo previamente descrito en la literatura como “tormenta de citoquinas”. Por el contrario, el sistema inmunitario del cerdo parece reconocer eficientemente el virus atenuado (E75CV1) inmediatamente tras la inocualación (día 1 pi., fig. 4A), controlando así la infección y facilitando la transición desde una respuesta inmune innata temprana a una respuesta inmune adaptativa de memoria y específica, claramente balanceada hacia una respuesta TH1, como refleja la transcriptómica del día 31 pi. en los animales supervivientes a la infección con E75CV1 (fig. 4C). Estos resultados parecerían confirmar la enorme relevancia de la respuesta T-CD8+ (citotóxica) en protección frente al VPPA, teoría defendida, entre otros, por nuestro propio laboratorio (Argilaguet et al; 2012; Lacasta et al; 2014; Takamatsu et al. 2012),. Todos estos resultados, además de confirmar la relevancia de disponer de un sistema inmune competente en la lucha contra el VPPA, permiten incorporar una nueva lección a las ya aprendidas, consistente en la demostración fehaciente de que entre los virus atenuados y virulentos han de existir además diferencias genéticas que faciliten por un lado la evasión del reconocimiento del sistema innato (Dixon et al., 2004) a tiempos tempranos (factores de virulencia presentes únicamente en los virus virulentos) y/o, por el otro lado, la existencia de factores que permitan amplificar el daño tisular a tiempos tardíos.

La capacidad de supervivencia tras la infección con el virus atenuado E75CV1 coincidió, como se acaba de comentar, con la activación de una respuesta de memoria de tipo TH1, con la detección específica de un elevado título de anticuerpos frente al VPPA detectables por ELISA (fig. 5A), así como de células T-específicas secretoras de IFNγ (fig. 5B). Con el objetivo de estudiar las capacidades protectoras de E75CV1, un grupo de animales se re-infectó con el virus virulento hermano E75 (homólogo) o bien con un virus del mismo genotipo (genotipo I) aislado unos años antes también en la península ibérica: BA71. Como cabía esperar de experiencias previas con éste y otros virus atenuados, todos los animales re-infectados con E75 sobrevivieron a la infección sin mostrar viremia ni síntoma alguno de la enfermedad (fig. 6).

En claro contraste, todos los cerdos infectados con BA71 sucumbieron a la enfermedad mostrando síntomas típicos de PPA y viremias muy elevadas (véase fig. 6). La ausencia de protección frente a BA71 permitió así confirmar a BA71 como un virus heterólogo, demostrando de nuevo las dificultades inherentes a obtener una vacuna universal o con protección cruzada (del inglés cross-protection). La última lección aprendida de estos estudios permitió correlacionar la capacidad de cross-protection con la presencia en los animales vacunados, de células T-CD8+ específicas capaces de reconocer y proliferar in vitro tras la estimulación con un determinado virus. Así, empleando un ensayo de proliferación basado en el marcaje con CFSE (del inglés carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) de las PBMC (del inglés peripheral blood mononuclear cells) obtenidas a partir de animales inmunizados con E75CV1 antes del desafío, permitió demostrar que las células T-CD8+ específicas tan solo proliferaban in vitro en respuesta al virus homólogo E75 pero no frente al heterólogo BA71 (fig. 7). En claro contraste, las células T-CD4+ y doble positivas T-CD4+CD8+ proliferaban en la misma medida con ambos estímulos. Estos resultados ratifican de nuevo la relevancia de las células T-CD8+ (CTL, del inglés Cytotoxic T-cells) en protección y podrían tener  importantes implicaciones para el futuro diseño de vacunas frente a la PPA, idealmente capaces de inducir tanto una respuesta humoral como celular, ambas esenciales en protección (Onisk et al 1995; Oura et al, 2005). Así, mientras que los anticuerpos podrían encargarse de eliminar al virus en suspensión (sangre, secreciones…); las células CTL serían responsables de eliminar en gran medida el virus intracelular.

Los resultados aquí mostrados abren nuevas vías para el futuro diseño de vacunas contra la PPA, principal objetivo tanto de nuestro grupo de investigación como de muchos otros en este campo. La obtención de una vacuna segura, eficaz y, sobre todo, de bajo coste, podría ayudar a controlar esta devastadora enfermedad muchas veces olvidada, sobre todo en las zonas del planeta más desfavorecidas en las que en ocasiones provoca la pérdida de su única fuente de proteínas.

Agradecimientos

Nuestra línea de investigación ha sido financiada desde su inicio, y prácticamente en su totalidad, por las autoridades competentes en Investigación y Ciencia del Gobierno Español, antes incluso de que la PPA volviera a instalarse en el continente Europeo. Este trabajo ha sido financiado gracias a los proyectos competitivos AGL2010-22229 yAGL2013-48998. Es de bien nacidos ser agradecidos.

Bibliografía

• Argilaguet, J. M., Perez-Martin, E., Nofrarias, M., Gallardo, C., Accensi, F., Lacasta, A., Mora, M., Ballester, M., Galindo-Cardiel, I., Lopez-Soria, S., Escribano, J. M., Reche, P. A. and Rodriguez, F. (2012). DNA Vaccination Partially Protects against African Swine Fever Virus Lethal Challenge in the Absence of Antibodies. PLoS One, 7, e40942.
• Dixon, L. K., Abrams, C. C., Bowick, G., Goatley, L. C., Kay-Jackson, P. C., Chapman, D., Liverani, E., Nix, R., Silk, R. and Zhang, F. (2004). African swine fever virus proteins involved in evading host defence systems. Vet Immunol Immunopathol, 100, 117-134.
• Lacasta, A., Ballester, M., Monteagudo, P.L., Rodríguez, J.M., Salas, M.L., Accensi, F., Pina-Pedrero, S., Bensaid, A., Argilaguet, J., López-Soria, S., Hutet, E., Le Potier, M.F., Rodriguez, F. (2014). Expression library immunization can confer protection against lethal challenge with African swine fever virus. J Virol., 88, 13322-13332.
• Lacasta, A., Monteagudo, P.L., Jiménez-Marín, Á., Accensi, F., Ballester, M., Argilaguet, J., Galindo-Cardiel, I., Segalés, J., Salas, M.L., Domínguez, J., Moreno, Á., Garrido, J.J., Rodríguez, F. (2015). Live attenuated African swome fever viruses as ideal tolos to dissect the mechanisms involved in viral pathogenesis and immune protection. Vet Res, 46, 135.
• Onisk, D. V., Borca, M. V., Kutish, G., Kramer, E., Irusta, P. and Rock, D. L. (1994). Passively transferred African swine fever virus antibodies protect swine against lethal infection. Virology, 198, 350-354.
• Oura, C. A., Denyer, M. S., Takamatsu, H. and Parkhouse, R. M. (2005). In vivo depletion of CD8+ T lymphocytes abrogates protective immunity to African swine fever virus. J Gen Virol, 86, 2445-2450.
• Ruiz Gonzalvo, F., Carnero, E. and Bruvel, V. (1983). Immunological responses of pigs to partially attenuated African Swine Fever Virus and their resistance to virulent homologous and heterologous viruses. . In: P.J. Wilkinson (Ed.), African Swine Fever. Proc. EUR 8466 EN, CEC/FAO Research Seminar. Sardinia. September 1981.206-216.
• Takamatsu, H., Denyer, M., Lacasta, A., Stirling, C., Argilaguet, J., Netherton, C., Oura, C., Martins, C. and Rodriguez, F. (2012). Cellular immunity in ASFV responses. Virus Res, S0168-1702.

Tomado de “Cría y Salud en Bovino y Porcino en Medicina Veterinaria” Axon comunicacion

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