Muestreo y tinción de especímenes

Muestreo y tinción de especímenes

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Pablo Manzuc1; Laura Denzoin Vulcano2
1 Graduado en la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP. Docente de la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, cátedras de Patología Médica y Hospital Escuela. Especialista en Dermatología de Pequeños Animales.
2 Médico Veterinario. Doctora en Ciencia Animal. Docente de Patología General de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires (UNCPBA), Tandil, Argentina

Muestreo

Es el acto que implica la obtención de la muestra y constituye un paso fundamental para recabar más y mejor información de la posterior observación microscópica. Cerca del 35% de los especímenes para estudios citológicos no pueden ser evaluados por errores en el muestreo.

El muestreo consta de 3 etapas consecutivas: la obtención de la muestra y su traslado a un portaobjetos; la extensión del material en el portaobjetos; y el secado o fijación de la muestra. La premisa básica al realizar estos pasos es tratar de manipular el material con la suficiente delicadeza para no producir rupturas celulares.

Obtención de la muestra

Existen 4 formas básicas de obtener células de un órgano o lesión. La elección de una u otra dependerá del tipo de tejido a
muestrear.
- Hisopados: Se utiliza fundamentalmente en cavidades o conductos (nariz, conducto auditivo externo, trayectos fistulosos, etc.). Esta técnica sólo permite obtener células que están en la superficie de la lesión. Se toma un hisopo de algodón, se lo apoya sobre la zona seleccionada de la lesión o se lo introduce en el conducto o trayecto (por ej., oído o fístula). Luego, antes que el hisopo se seque con el aire, se lo hace rotar sobre un portaobjetos adecuadamente limpio y desengrasado. Nunca se debe frotar el hisopo sobre el portaobjetos, ya que esto produce una gran ruptura celular. Esta técnica no requiere una posterior extensión.
 - Ventajas: Técnica de muy fácil realización, mínimamente dolorosa e invasiva. Materiales de muy bajo costo.
 - Desventajas: Se recolecta muy escaso material. No se puede juzgar la profundidad del proceso. Muy frecuentemente se observan reacciones inflamatorias agudas polibacterianas de superficie, las cuales no son representativas de toda la lesión. 
 - Usos: Fundamentalmente son útiles para el estudio de conductos naturales (conducto auditivo externo, fosas nasales), fístulas o pústulas y sacos conjuntivales.
 - Notas: Cuando se realizan hisopados de lesiones ulcerosas, conviene eliminar con una gasa embebida en solución fisiológica todas las costras y los detritos que podrían contaminar la muestra.
- Raspados: Consisten en raspar los bordes o la superficie de una lesión con un bisturí o una hoja de afeitar. El material
así recogido se deposita en un extremo de un portaobjetos para su posterior extensión. El raspado debe realizarse muy
suavemente, hasta observar un suave sangrado (hay que recordar que la excesiva cantidad de sangre luego dificulta
la observación).
 - Ventajas: Técnica de fácil realización y muy poco dolorosa. Se pueden obtener buenas muestras de lesiones de las que el hisopado no produce una adecuada exfoliación celular.
 - Desventajas: Si la lesión es muy sangrante, se produce una excesiva contaminación hemática. Frecuentemente se observan reacciones inflamatorias polibacterianas agudas de superficie.
 - Usos: Es muy útil para obtener muestras de lesiones ulcerosas poco voluminosas y, principalmente, de carcinomas de células escamosas.
 - Nota: La limpieza superficial con una gasa embebida en solución salina ayuda a eliminar la contaminación superficial.
- Improntas: La técnica consiste en apoyar directamente el portaobjetos sobre la lesión a muestrear. Existen básicamente
2 tipos de improntas: las de superficies externas y las de superficies de corte. Para la primera, se apoya suavemente el portaobjetos sobre una lesión ulcerosa o sobre el exudado de un trayecto drenante; para la segunda, se apoya el portaobjetos sobre la superficie de corte de una lesión o un nódulo previamente extirpado. Si el material obtenido es
escaso, no es necesaria una posterior extensión.
 - Ventajas: Muy fácil ejecución. Muy efectiva cuando se realiza en las superficies de corte de tumores de células redondas (TVT, mastocitoma, linfoma) y algunos carcinomas con células fácilmente exfoliables.
 - Desventajas: Si la lesión es muy sangrante, se produce una excesiva contaminación hemática. Frecuentemente se observan reacciones inflamatorias polibacterianas agudas de superficie. No tiene ninguna eficacia en el diagnóstico de la mayoría de los tumores mesenquimáticos (salvo que sean de alta malignidad)
 - Usos: Se utiliza como técnica de muestreo de exudados semilíquidos (pus) o presuntos TVT (sobre el tumor sospechoso)
y como técnica intraoperatoria en la “cama” de un tumor recién extirpado (para evaluar la presencia de células neoplásicas residuales).
 - Nota: La limpieza superficial con una gasa y solución salina ayuda a eliminar la contaminación superficial.
- Punción y aspiración con aguja fina (PAAF): Es la técnica de elección en la mayoría de las situaciones. La realización
de una punción con aguja fina tiene por objetivo obtener material del centro mismo de una lesión. Se requiere de una aguja 25/8 (puede ser más gruesa, si se sospecha de una tumoración de origen mesenquimático), una jeringa de 5 o 10 ml y los portaobjetos perfectamente limpios y desengrasados. Los pasos son los siguientes:
1. Se introduce la aguja acoplada a la jeringa en el centro de la lesión a muestrear.
2. Se realizan 3 o 4 golpes de vacío con la jeringa, llevando el émbolo hasta la línea de los 5 a 7,5 ml.
3. Sin ejercer vacío y sin retirar la aguja de la lesión, se la redirige hacia otra porción.
4. Se vuelven a realizar 3 o 4 golpes de vacío como los anteriores.
5. Se reorienta nuevamente la aguja sin hacer vacío con la jeringa.
6. Se repiten los golpes de vacío. El material queda dentro de la aguja; no debe pasar al interior de la jeringa. Tampoco debe observarse sangre en el cono de la aguja, ya que ésta luego obstaculiza la visualización celular.
7. Sin sacar la aguja de la lesión, se desacopla la jeringa. Este paso se realiza para evitar que la posible presión negativa residual de la jeringa arrastre el materias desde dentro de la aguja hasta el cono, inutilizándolo.
8. Se retira la aguja.
9. Se carga la jeringa con 5 cc de aire.
10. Se acopla nuevamente la jeringa.
11. Se posiciona la aguja en un ángulo de 45º con un portaobjetos limpio y desengrasado, y se descarga bruscamente el aire (así, el material es “soplado” desde el interior de la aguja hacia el portaobjetos).
12. Se pueden repetir los pasos 8, 9, 10 y 11 para obtener más material que pueda haber quedado en la aguja.
13. Se procede rápidamente a la extensión.

Extensión de la muestra

En este acto, las células obtenidas se distribuyen homogéneamente en la superficie del portaobjetos, intentando dejar una monocapa celular que facilite la observación microscópica. Las extensiones mal realizadas producen grandes rupturas celulares. Para evitarlas, debe tenerse en cuenta:

El proceso de extender una  muestra es único, es decir, no se repite. Si una muestra quedó mal extendida, no debe volver a
extenderse. Debe tomarse una nueva muestra para repetir el proceso.

La extensión debe ser rápida. No debe pasar mucho tiempo entre la toma de la muestra y su extensión (apenas unos segundos), ya que hay muestras que se secan velozmente (por ej., tejidos linfoideos) y, cuando se extiende una muestra semiseca, se producen grandes rupturas celulares.

Las posibles modalidades de extensión incluyen:

Extensión clásica para hematología: Se utiliza sólo cuando la muestra es muy líquida. Con un portaobjetos (denominado “extensor”), preferentemente con el borde más angosto que un portaobjetos común y ubicado a 45º, se toca la muestra a extender y se la desliza suavemente hacia el otro extremo del portaobjetos.

Para muestras semisólidas: Se toma un segundo portaobjetos, limpio y desengrasado, y se lo apoya transversalmente y de plano sobre la muestra a extender; luego, se lo desliza rápida y suavemente hacia el otro extremo.

Existen otras muchas formas de extender una preparación, pero el veterinario debe familiarizarse con la que mejores resultados le brinde.

Secado y fijación

Normalmente, el secado es al aire y suele tardar unos minutos. Las muestras deben dejarse sobre un lugar limpio. Algunas muestras no se secan debido a su contenido lipídico (por ej., aspirados de lipomas o tejido adiposo subcutáneo). Las 
muestras, una vez secas, sufren mínimo deterioro y pueden conservarse durante largos períodos. Sin embargo, para  mantener intactas las células, puede procederse a la fijación, para lo cual las muestras previamente secas se sumergen en alcohol metílico o algún fijador comercial durante unos 15 a 20 segundos.

Tinción

Existen múltiples técnicas de tinción. Para estudios citológicos, se utilizan como rutina:
- Diff-Quik (tinción 15): Consta de un fijador inicial, un colorante eosinofílico y uno basofílico. Es muy rápida (todo el proceso tarda menos de 2 minutos). Permite obtener una buena coloración diferencial entre núcleo y citoplasma. La
mayoría de las granulaciones  captan los colorantes (excepto los gránulos de algunos mastocitomas). Permite distinguir
perfectamente los somas bacterianos, las levaduras y la mayoría de los hongos, así como también parásitos (Leishmania).
Comparada con otras técnicas, es menos nítida que la tinción de May-Grünwald / Giemsa, pero tiene la ventaja de que es más rápida.
- May-Grünwald / Giemsa: Brinda una excelente tinción, con muy buen contraste entre núcleo y citoplasma. Consta de un primer colorante, el de May-Grünwald (que tiene incorporado alcohol metílico como fijador), y el colorante de Giemsa (que debe ser preparado, en el momento, preferentemente con amortiguador fosfato). Permite observar perfectamente los nucleolos, los somas bacterianos, las levaduras, los hongos y los parásitos. Tiñe todas las granulaciones, incluso aquellas que no captan la tinción Diff-Quik. Todo el proceso de coloración tarda aproximadamente 25 minutos y esta demora es,  justamente, su mayor desventaja. Gram: Es la tinción clásica para bacterias. Siempre es conveniente dejar sin colorear un
par de preparaciones, por si se ven somas bacterianos en las tinciones de rutina y se tiene que hacer una tinción de Gram. Ésta no se usa como rutina ni como tinción principal. Distingue perfectamente las bacterias grampositivas de las de  gramnegativas y su morfología, y estos datos son de gran ayuda a la hora de seleccionar una droga antimicrobiana cuando no se cuenta con un cultivo como guía.
- Ziehl-Neelsen: Debe utilizarse siempre que se sospeche de micobacteriosis (figuras de bacterias “fantasmas” dentro de macrófagos teñidos con colorantes de rutina). Sirve para distinguir bacterias ácido- alcohol resistentes.
- Azul de metileno: Es utilizado para algunos estudios citológicos en particular, como la citología vaginal. Consta de un solo colorante. La tinción es muy rápida, pero su nitidez es menor que la de otras técnicas. Existen muchas otras tinciones para circunstancias particulares, sin embargo, en la práctica, se utilizan una como base (Diff-Quik o May-Grünwald / Giemsa) y una o dos tinciones secundarias (Gram y/o Ziehl-Neelsen), según lo observado en la tinción primaria.

 


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